SILVER CHINS

Шиншилловая ферма

Белковое питание и отзывчивость лимфоцитов на фитомитогены у шиншиллы.

Robert J. Hudson, Carol A. Paulson,  Dorothy Emsie, Guy L. Kerr, and W. D.  Kitts

Department of Animal Science, University of British Columbia, Vancouver 8, British Columbia

Опубликовано: 6 June, 1973

Перевод на русский язык: В.В. Дадижа.  Редакция: Д.В. Михайлов

Функциональные ответы invitro (в пробирке – прим. пер.) лимфоцитов селезенки и костного мозга шиншилл, содержащихся на рационах с диапазоном сырого протеина от 11,2 до 24,5%, были оценены с использованием двух растительных митогенов, фитогемагглютинина и конканавалина А. Пониженный питательный статус сопровождался общим улучшением отзывчивости лимфоцитов костного мозга и ухудшением лимфоцитов селезенки. Обратная зависимость между реакциями клеток этих двух органов позволяет предположить, что после умеренного, но длительного пищевого стресса может произойти перераспределение чувствительных к митогену клеток из селезенки в костный мозг.

Вступление

Повышенная восприимчивость ко многим инфекциям от недостатка белка в питании детей и животных является хорошо известным феноменом (Scrimshaw et al. 1968). Эта повышенная восприимчивость в целом объясняется нарушением синтеза иммуноглобулина. Тем не менее, картина кажется осложненной наличием сопутствующих инфекций; уровни циркулирующего иммуноглобулина могут быть уменьшены, неизменны или даже увеличены при нехватке белка в питании (Alvarado и Luthringer 1971; Zucker et al. 1971). Несколько более согласующихся результатов было достигнуто в исследованиях индукции специфического антитела. (Kenney et al. 1970 и Piedad-Pascual et al. 1970) отметили нарушение способности экспериментальных животных реагировать на первичную иммунизацию (вакцинация). Пониженные титры антител были связаны с уменьшением количества образующих антитело клеток в лимфоидной ткани. В других исследованиях добавление белков в рацион привело к быстрому восстановлению способности вырабатывать антитела (Mathews et al. 1972).

Тем не менее, клинические и экспериментальные данные позволяют предположить, что увеличение частоты заболеваний у особей с дефицитом белка не всегда объясняется снижением синтеза антител. Smythe et al. (1971) и Mc Farlane (1972) утверждали, что из многих факторов, способствующих повышенной восприимчивости, клеточный иммунный ответ, вероятно, был наиболее важным.

Клетки, вовлеченные в клеточно-опосредованную иммунную реакцию, в значительной степени зависят от тимуса (Т-клетки). Определенная часть фактически проходит через тимус, тогда как на другие влияют гормональные механизмы в периферической лимфоидной ткани (White и Goldstein 1972). Зависимые от тимуса клетки можно отличить от антителообразующих клеток (В-клетка, бета-клетка), происходящих из костного мозга, по их способности трансформироваться при культивировании в пробирке растительными митогенами, фитогемагглютинином (PHA) и конканавалином A (Con A) (Andersson et al. 1972). В дополнение к этому отличию два подмножества T-клеток были идентифицированы на основе характерного дифференциального ответа на эти два митогена (Stobo и Paul 1973). Одно из этих подмножеств, по-видимому, одинаково реагирует на PHA и Con A, а другое реагирует в гораздо большей степени на Con A. Это исследование было проведено, чтобы определить зависит ли отзывчивость Т-лимфоцитов и их подмножеств из селезенки и костного мозга растущей шиншиллы (Chinchilla lanigera) от белкового питания.

Материалы и методы

Двадцать шиншилл, отнятых от матерей, весом около 275 г были распределены на один из пяти изокалорийных рационов с содержанием сырого белка от 11,2 до 24,5% (таблица 1). Животные содержались на этих диетах в течение 134 дней. Пищевой статус экспериментальных животных оценивали на основе конечной массы тела и отложения азота, определенных из серии четырех испытаний азотного баланса с использованием процедур, описанных Rogier (1971). В конце исследования питания 16 животных (4 от каждого из двух рационов с высоким содержанием белка, 3 от каждого из двух промежуточных рационов и 2 от рациона с низким содержанием белка) были умерщвлены для оценки функции лимфоцитов в соответствии с процедурой, описанной ниже.

Селезенка и одна цельная бедренная кость были изъяты у каждого животного и помещены в стерильный соляной раствор с фосфатным буфером. Клетки были препарированы из селезенки в 5мл среды M-199 (Difco, Detroit). Суспензию монодисперсных клеток готовили путем аспирации через пипетку Пастера и разбавляли до 20 мл с М-199, содержащим 200 мМ/мл глютамина и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина. Бедренную кость открывали на каждом конце и промывали 6 мл среды. Группы клеток диспергировали, асуспензию клеток аналогично разбавляли, дополняя до 20 мл, М-199. Разбавленные клеточные суспензии клеток селезенки и костного мозга подсчитывали и разливали в одноразовые культуральные пробирки 12 × 75 мм (Falcon-Plastics, Oxnard) кратные 1,7 мл.  Затем объемы культуры доводили до 2 мл путем добавления 0,3 мл стерильной овечьей сыворотки. Дублирующие культуры служили в качестве контроля или же были обработаны 0,1 мл фитомитогенов, конканавалином А (Pharmacia, Uppsala) из исходного раствора 1 мкг/мл или фитогемагглютинином М (Difco, Детройт), регидратированного в соответствии с инструкциями производителя.

После инкубации плотно закрытых пробирок в течение 52 ч при 37°с культуры вибрировали с помощью помеченного тритием тимидина (H3-TR, удельная активность 5000 мКи/ммоль, Amersham-Searle). После инкубации в течение еще 16 ч среду удаляли, и осадок клеток дважды промывали солевым раствором с фосфатным буфером (0,01 М фосфата; рН 7,2), дважды трихлор-уксусной кислотой (5% мас./Об.) и один раз метанолом в соответствии с процедурой, описанной Caspary и Hughes (1972).

Таблица1: Состав экспериментальных рационов

Составляющая

Содержание сырого белка в рационах

11,2

12,6

18,4

21,0

24,5

солома пшеницы

20

20

20

20

20

соевая мука

17

23

30,3

34

40,2

ячмень

8

16,5

20

22

26,8

сахароза

44

29,5

18,7

13

2

кукурузное масло

2

2

2

2

2

Durabond (клей)

3

3

3

3

3

витаминно-минеральный премикс и его носитель

6

6

6

6

6

Примечание: компоненты выражены в процентах по весу.

Промытый остаток был помещен в 0,5 мл гидроксида гиамина (New England Nuclear) при 60°с на 1 час и добавлен к 10 мл сцинтилляционной жидкости (5,0 г 2,5-дифенилоксазола (PPO), 0,3 г п-бис-(2-(5-фенилоксазол)) - бензол (POPOP) в 1 литре толуола) в ампулу для подсчета радиоактивности. После охлаждения и тщательного встряхивания образцы считывали в течении 10 минут с помощью жидкого сцинтиллятора (Isocap 300, Nuclear Chicago). Результаты были скорректированы по эффективности и скорости остановки реакции, и записаны как распад в минуту на 106 клеток. Эти скорректированные значения были логарифмически преобразованы и выражены напрямую как грубая стимуляция либо как чистая стимуляция после вычитания количества контрольных культур.

Результаты и обсуждение.

Диеты и продуктивность животных.

Предлагаемые диеты влияли на продуктивность животных, которая измерялась как прирост массы тела и отложение азота (Таблица 2). Тем не менее, эти показатели продуктивности животных сильно различались, так как некоторые животные адаптировались к низкокачественным рационам, компенсируя их повышенным потреблением корма. Поскольку эта изменчивость имела тенденцию маскировать эффекты от питания, для последующих анализов параметры иммунологической функции были регрессированы против показателей продуктивности животных (массы тела и отложения азота).

Реакция выращенных клеток в пробирках на фитомитогены.

Клетки костного мозга и селезенки шиншиллы реагировали как на конканавалин А, так и на фитогемагглютинин. Хотя периферические лимфоциты (кровь, селезенка и лимфатические узлы) большинства видов реагируют на эти митогены в культуре, способность к реагированию лимфоцитов костного мозга варьируется (Moorhead и Claman 1972; Byrdetal. 1973). Конканавалин А и фитогемагглютинин специфичны для тимусных клеток, которые могут находиться в центральной или периферической лимфоидной ткани (Janossy и Greaves 1971).

Таблица 2: Изменения массы тела и отложение азота ушиншилл, отнятых от матерей, при питании с различным содержанием сырого белка.

Сырой белок в рационе

Количество животных

Средний общий прирост, г

Среднее общее отложение азота

11,2

4

88+-75

0,25+-0,13

12,6

4

138+-23

0,35+-0,06

18,4

4

142+-16

0,58+-0,09

21,0

4

130+-18

0,45+-0,25

24,5

4

160+-21

0,68+-0,14

Примечание: Средний общий прирост и среднее общее отложение азота выражены как измеренное значение +- стандартное отклонение.

Стимулирующее соотношение PHA/Con A у шиншиллы составляло 0,94-0,98 для селезенки и 1,00-1,05 для костного мозга. У "CBA/J" мышей это соотношение достигает 0,72 в селезенке и 0,39 в костном мозге (Stobo и Paul 1973). У мышей подмножества с высоким соотношением находятся преимущественно в селезенке, тогда как у шиншиллы они, по-видимому, равномерно распределены между селезенкой и костным мозгом.

Питание и отзывчивость InVitro

В целом, реакция клеток костного мозга была обратно пропорциональна показателям продуктивности животных, при этом стимуляция скудно питающихся животных превышала таковую у хорошо питающихся в 3-5 раз (таблица 3, таблица 4). Чувствительность к Con A, выраженная как грубая или чистая стимуляция, отрицательно коррелировала и с массой тела и с максимальной ретенцией азота. Валовая, но не чистая стимуляция PHA отрицательно коррелировала с отложением азота.

Таблица 3: Коэффициенты регрессии, описывающие значимые (Р<0.5) взаимосвязи между валовой стимуляцией и измерениями пищевого статуса.

Происхождение клеток и стимулятор

Масса тела

Удержание азота

Контроль кость

-0.0112

(-2.457, P=.08)

Кость Con A

-0.0155

-4.352

Контроль селезенка

н.з.

-5.460

Селезенка Con A

н.з.

-2.778

Селезенка PHA

+0.0112

н.з.

Примечание:  Незначительно, н.з.  В круглых скобках обозначены коэффициенты регрессии, приближающиеся к значимым.

Таблица 4: Коэффициенты регрессии, описывающие значимые (Р<0.5) взаимосвязи между чистой стимуляцией и измерениями пищевого статуса.

Происхождение клеток и стимулятор

Масса тела

Отложение азота

Кость Con A

-0.0140

-3,956

Кость PHA

н.з.

н.з.

Селезенка Con A

н.з.

(+2.795, P=.08)

Селезенка PHA

+0,0138

+7,222

Заметка:  Не значительно, н.з.  Круглые скобки обозначают коэффициенты регрессии, приближающиеся к значимости.

С другой стороны, стимуляция клеток селезенки оказалась напрямую связана с производительностью. Валовая стимуляция PHA напрямую связана с массой тела. Чистая стимуляция PHA значительно коррелировала как с массой тела, так и с максимальным отложением азота. Реакция на Con A не была статистически значимой, но также имела тенденцию демонстрировать прямую связь с продуктивностью животных.

Buckleyandco-workers (1973) подчеркнули различие этих двух методов выражения чувствительности лимфоцитов (чистая и грубая стимуляция). Способность клеток к трансформации может быть ухудшена из-за нарушения способности синтезировать нуклеиновые кислоты или из-за того, что клетки спонтанно подвергаются трансформации со скоростью, при которой стимуляция неэффективна. В этом исследовании наблюдалась та же качественная картина, независимо от того, валовые или чистые измерения симуляции были использованы. Однако, хотя эта картина не была замаскирована, фоновая стимуляция (включение тимидина в контрольную культуру) была связана с пищевым статусом (таблица 3). Спонтанная трансформация в культурах селезенки и костного мозга отрицательно коррелировала с отложением азота. В культурах костного мозга фоновые показатели коррелировали как с максимальным отложением азота, так и с массой тела. Основа такой реакции непонятна. Однако это может быть связано с более молодым физиологическим возрастом, широко наблюдаемым у животных на ограниченном рационе. Stitesetal. (1972) сообщили о снижении спонтанной трансформации лимфоцитов по достижении зрелости.

Необычная обратная связь между чувствительностью селезенки и костного мозга к растительным митогенам была несколько неожиданной. Ответ лимфоцитов из периферического отсека (селезенка) согласуется с более ранними исследованиями. Smythe et al. (1971) обнаружили сниженную чувствительность лимфоцитов к фитогемагглютинину при недоедании. Hudson (1973) обнаружил сходную реакцию лимфоцитов периферической крови у снежных баранов, подвергшихся стрессу. Если этот ответ характерен для всех типов стресса, его можно интерпретировать с точки зрения действия глюкокортикоидов, которые вызывают тимолимфатическую инволюцию посредством действия цитолитов на лимфоциты. Тем не менее, исследования показали, что лечение кортизоном в физиологических пределах может, на самом деле, быть выбрано для популяции митоген-чувствительных клеток таким образом, что стимуляция на базис клетки может быть увеличена (Levine и Claman 1970). Это обогащение чувствительных клеток является одним из возможных объяснений усиленного ответа костного мозга, но недавняя работа Moorhead и Claman (1972) выдвинула другую гипотезу. В их исследовании было обнаружено, что введение гидрокортизона вызывает перераспределение устойчивых к кортизону, PHA-чувствительных клеток из селезенки в костный мозг. Аналогичные наблюдения были сделаны Коэном (1972). Это, по-видимому, является правдоподобным объяснением быстрого лимфосепениса и ингибирования рециркуляции клеток после стресса или лечения кортизоном (Spry 1972).

Мало что известно о механизме этой видимой секвестрации. Гормональные изменения могут менять поверхностные составляющие клеток, которые необходимы для нормальной рециркуляции, либо могут влиять на эластичность стенок сосудистой сети костного мозга, делая ее менее проницаемой для выхода клеток.

Отношения стимуляторов PHA к Con A при пищевом стрессе значительно не менялись. Тем не менее, соотношение стимуляторов костного мозга, как правило, было ниже (P = .20), тогда как соотношение для селезенки, как правило, было выше (P = .08) у животных с улучшенным питанием. Поскольку высокие стимуляционные соотношения характерны для быстро рециркулирующего подмножества T-клеток (Stobo и Paul 1973), это может указывать на то, что перераспределение клеток из периферических лимфоидных тканей в костный мозг может быть предпочтительным. Тем не менее, существует ряд альтернативных объяснений, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы поддержать это утверждение.

В данном исследовании было показано, что белковое питание вызывает изменения чувствительности митоген-чувствительных клеток селезенки и костного мозга. Хотя это является косвенным доказательством, обратная связь, существующая между лимфоцитами в этих двух органах, позволяет предположить, что перераспределение Т-клеток из селезенки или, возможно, других периферических лимфоидных органов в костный мозг может происходить подобно тому, которое наблюдается после экспериментальной инъекции кортизона. Это явление может способствовать нарушению клеточного иммунитета, связанного с ограничением питания.

                                           

© 2008-2019. SilverChins. Развитие шиншиловодства в России. 

Все материалы, опубликованные на сайте в любом виде, являются объектами авторского и имущественного права. 

Любое их использование должно быть согласовано с администрацией сайта.